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| Toxikon:一个符合现代毒物的古代单词 |
| 更多相关文章 时间:2008/4/21 11:25:31,点击:0 |
| 作者：Jeffrey H.Hays
学习目的
1、描述用于筛查药物的技术和方法
2、识别用于药物试验的样品类型
3、区别用于药物试验技术的命名法
4、确认用于药物试验的不同地点
毒物学起源于弓和箭，指的是古希腊的弓和箭。有毒的、毒素、麻醉性毒品、毒物学等这些名词其根源均来自丘比特（Cupid）的小弓箭（真正的爱神是Eros，丘比特是古罗马人而不是希腊人）。希腊语中的“toxa”指的就是射箭用的弓和箭。“Toxikon”一词原指的就是浸了毒药的箭，后逐渐演变为泛指任何毒物的代名词，并最终变成了我们现在所用的一个单词——毒物（toxin）。顾名思义，毒物学就是对毒物进行研究的科学，毒物学筛查就是寻找毒物。由于相当一部分毒物已在世界上消失，因而目前所用的术语“毒物学筛查”已经泛指为测试药物（处方药、非处方药和违禁药品）和人们因意外或有目的的摄入天然出现的化合物。
人们想要检测药物的理由有很多。医疗保健机构需要对急症患者进行筛查、或对住院患者所摄入的不适当药物或由来访者带进来的药物进行检查，企业需要检测工人对毒性物质的接触情况。法律争论的问题也成为法医毒物学的主题。法医毒物学家学会（Society of Forensic Toxicologists）在网站上给出了以下定义：
死后法医毒物学……测定人体液和组织中是否存在有药物及其代谢产物、包括乙醇和其它易挥发物在内的化学品、CO和其它气体、金属和其它毒性化学品等，评估它们在死亡原因和方法中是否起到决定性因素或是辅助性作用。
人行为法医毒物学……测定血液、呼吸或其它适合样品中是否存在有乙醇、其它药物和化学品等，并评估其在改变人的表现和行为方面的作用。
法医尿液药物试验……测定尿液中药物及其代谢物的存在与否，判断事先是否用过或滥用过药品。
很多技术和方法都可用于药物筛查，但各有其优缺点，因而通常的做法是将一些技术结合起来用于准确测定特定药物的存在与否。在大多数的探索领域内，毒物学有其自己的术语和专业行话，包括一份“字母汤alphabet soup”。
药物认别专家（DRE）胜过一个检察官
法律执行机构有责任强制执行驾车者的饮酒规则。在这一领域内第一个药物筛查的评估是由药物识别专家（DRE）进行的。DRE是经过专门培训后从事识别和评估药物对人的作用效应的官员。除标准的现场清醒测试外，DRE也会观察被检者眼部运动的改变、瞳孔大小、体温、心率、呼吸、速率、肌肉紧张度和控制情况、精神状况等。通过采用清单和图表等DRE一般都能对影响被检者的药物类别或药物做出判断。
固相免疫测定（Immobilized IA）
对于快速现场检测来说，免疫测定方法是可以采用的方法之一。虽然免疫检测方法应用简便，但其制备过程却是复杂的。它们包括有针对特殊药物和药物偶联复合物的抗体。样品被加入后通过介质移动，样品中的药物和药物偶联复合物与抗体进行竞争性结合。有些方法采用的是在特殊位点上出现一条线或带以表示相关药物存在；还有一些方法则相反，在特殊位点上没有线或带的出现表示为阳性结果。这些方法可以是单一药物检测和多种药物联检包装，可以在医师办公室、急症室、法律执行部门等许多环境下应用。一些尿液收集容器内装有检测装置，被检者提供的尿液样品可以在数分钟内给出检测结果。有些方法亦可采用其它液体样品进行检测。例如一种方法通过一个咽拭子获取口腔内液体进行检测。这类试验可在路旁完成，不需要卫生间。
人人需要一点薄层层析（TLC）
当样品被送至实验室后，最古老和多用途的筛查技术之一是TLC，即薄层层析。我们中的大多数人只是在中学实验室内首次接触到薄层层析。这种试验的方法是在靠近一张滤纸的底部放几滴带颜色的墨水，然后将滤纸悬在溶剂的上部，只有纸的底边刚好在溶剂中。当溶剂通过毛细管作用移向滤纸时，墨水的主要颜色被分离并沿滤纸停在不同的位置。目前已有商品化的薄层层析系统，但有些实验室仍采用将薄层硅胶包被玻片的方法自制层析板。但不管是采用这两种方法的哪一种，其技术都是类似的。
采用一种适当的溶剂从样品中抽提药物，通过蒸发溶剂使其浓缩。浓缩后的样品被放在薄层层析谱上，使溶剂移向层析谱。当溶剂差不多到“谱”的顶端时，取出层析谱并干燥。通过采用多种化学浸洗和喷雾并在紫外线下观察在预料的高度和对不同试剂所预料的颜色改变来表示药物的存在。很多药物代谢谱可用同样方法观察。纯的药物的标准点经常被包含在层析谱中用于未知样品对比用。TLC几乎可以检测任何药物。
TLC用途多样但操作步骤费时费力。由于在同一溶剂内不能提取全部的药物，因而在做全面筛查需要进行多种抽提。TLC还有可能存在的问题包括当有很多药物移动至同一高度时可能会干扰对结果的解释：一种高浓度药物通过大范围的色谱扩散可能会掩盖其它药物的存在。一般地说必须经过大量的培训和实践才能准确判断TLC结果。有着多年工作经验的优秀毒物学家几乎闭着眼睛就能读出层析谱的结果——仅仅从充满溶剂气味的老式化学、试剂的检测和混合、试管的振摇和位于眼前斑点的色彩——这是一个丰富多彩的技术。
字母表
目前应用最广泛的筛选技术是免疫测定（IA）。这些测定通常采用一些首字母缩略词来表示，有些已经商标化，如：RIA、EMIT、ELISA、FPIA、MEIA和CEDIA。有些标记采用的是均相（反应与判读在同一反应物中），有些为非均相（抗体被包被在反应容器上或沉淀于反应混合物外，测定前去除过量反应混合物）。即使反应方向不同，大多数的免疫测定都可用分光光度计进行结果判读。在一些测定中，高的光密度读数相当于较高的药物浓度；而另一些测定中较高的光密度读数则意味着无或很少有药物存在。大多数的免疫测定可采用专用的药物测定分析仪和常规化学分析仪进行。它们可以在包被有抗体的微孔板上进行测定。这些微孔板可以通过采用机器人加液器、自动洗板机和高速分光光度计阅读器来进行自动化测试。
无论应用什么特殊方法都会遵循相同的模式。即需要有针对一种或数种待测药物的抗体、样品、药物—偶联试剂（药物附在能用物理方法测定的实体如放射性碘、酶、胶乳颗粒、免疫球蛋白、荧光分子等上）。上述这些一同混合后，样品中的药物与药物—偶联试剂在抗体结合位点上竞争结合。经孵育后检测药物—偶联物的存在与否。
作为一个特殊例子，最简单的免疫测定是包被管放射免疫测定——RIA。我们举一个LSD试剂盒的例子。在这个测试盒中，制造商采用LSD抗体包被聚乙烯试管内壁。样品与LSD—偶联试剂被一同加入。大多数RIA试验的偶联物采用的是放射性碘（Ⅰ-125）。孵育后从试管中倾出反应混合物，用r计数仪检测留在试管内的碘的放射活性。管内每分钟碘放射活性计数高表示有大量LSD-偶联物结合至抗体，也就意味着样品中的LSD浓度很低或无。相反，管内计数低则表示管内LSD-偶联物量少，表明样品中有大量LSD结合至大多数的抗体结合位点上。
免疫测定亦可分为两个附加分类：特殊药物的试验[例如芬太尼（fentany1）、丙氧芬（propoxyphene）、扑热息痛（acetaminophen）]和传统药物试验[鸦片制剂（opiates）、苯并二氮卓类（benzodiazepines）、三环抗抑郁药（tricyclic antidepressants）等]。由于不同种类的特殊药物可与药物的代谢物发生交叉反应，因而可将测试方法设计成只与游离的未结合药物分子发生反应或设计为检测药物的所有形式。检测药物的试剂盒在设计上应考虑到尽可能包括有只与要检测的相关类药物反应但却不和大小与结构类似的其它化合物反应的抗体。例如市场上约有30种苯并二氮卓类，大多数免疫测定试剂盒适合于测定类似安定（diazepam）、羟基安定（temazepam）和去甲羟安定（oxazepam）之类的苯并二氮卓类。它们与阿普唑仑（alprazolam）及氯硝西泮（clonazepam）仅存在着有限的交叉反应。大多数的鸦片制剂检测试剂盒适合检测吗啡，但与羟考酮（oxycodone）有着一定程度上的交叉反应。一个苯丙胺（amphetamine）试剂盒可检测苯丙胺（MDA）和一些非处方药（减轻充血的药），但不能检测甲基苯丙胺（methamphetamine）和MDMA。应用时可以根据怎样进行全面筛查的需要来选用测同类药物的一些试剂盒。
免疫测定的优点是特异性和敏感性高、样品无需或很少需要进行准备、速度快，且可高度自动化。免疫测定对工作量大和需要周转时间快的实验室来讲是最好的选择，也非常适合急诊室所做的单一筛查。由于其具有高敏感性，因而在药物的排除上也很有价值。
有关免疫测定的最后一个注意点是：尽管它们对药物或设计测定的药物有着最好的特异性和敏感性，但试剂盒内的说明书也告诫我们这些免疫测试有可能与一些其它化合物发生交叉反应，我们应充分意识到这些情况。样品中一种药物浓度较高时可能会掩盖其它欲测试的抗体。由于有很多药物的确可发生交叉反应，因此结果会出现多种药物试验阳性，而实际上仅仅只有一种药物过量。制造商可能只测试了另外10种具有类似结构的药物，发现它们与此试剂盒无交叉反应；但被测试的样品中恰恰就可能含有制造商未进行交叉反应试验的第11种药物。
石头、纸、剪刀
临床上采用更先进仪器进行的一些筛查方法包括HPLC、GC、GC-MS和LC-MS等。这些技术像TLC一样有着共同的特征，那就是在分析前药物必须从样品中进行抽提。目前所应用的两种主要抽提方法为：液-液抽提和固相抽提（SPEs）。液-液抽提中水溶液样品与非水溶液溶剂混合。在抽提过程中可加入缓冲液、酸和碱以调节pH，使待检药物进入非水溶液性溶剂中。经数次反复抽提后——往返水相与非水溶性溶剂之间，需要去除蛋白质和其它生物化合物以便获得一个可以放入分析仪中的清洁样品。固相抽提采用能结合药物活性位点的小树脂柱或浸有树脂的小圆滤纸。通常在样品加样到固相前要有预处理步骤，加样后可用缓冲液和溶剂漂洗固相以便在药物洗脱前去除干扰物质。
现在制备的样品必须选择一种分离技术：GC、LC和CE等。层析法的要点是将药物和化合物的混合分子分离为精密牢固的小包，每个小包为一种化合物。当这些小包到达分析柱的末端时可进行检测。可选择的检测方法包括FID、NPD、ECD、PDA，当然最重要的检测装置是质谱仪（MS）。
质谱仪是极佳的检测分析仪，因为它能对样品中的药物进行鉴定。当药物小包进入质谱仪后，药物分子被破裂分离为离子片段，然后计算比质量中的片段量。每种药物的总离子计数（total-ion-count，TIC）类型实际上都是独一无二的。应用GC中药物保留时间和质谱仪的总离子计数能确保合理准确地识别有疑问的药物。
真人秀（Reality TV）？
在电视剧里会看到罪犯犯罪后法医专家常常会用质谱仪来神奇地获得犯罪的证据。当一个实验人员坐在计算机旁调阅一份文件观看时，首先显示出总离子VS时间图，它看上去就像任何层析谱一样有峰和谷。通过选择一个有兴趣的峰后，TIC会显示成线（更像一个长条图），每根线都与一个比质量有关，每根线的高度都与这一比质量的片段的总计数有关。计数越多、线越高。资料库寻找的是TIC完成的数百种药物及化合物的质谱数据。
大多数质谱仪都安装有一些资料库，计算机最终通过它们寻找可能的匹配、显示资料库TIC，并表明特殊TIC符合资料库数据的百分率。有时资料库会提供最为匹配化合物的化学结构图形，使用者可在TIC的选择部分上快速移动、放大图像、去除背景干扰、抽提比质量，并用其它精确高水平的特色TIC。使用质谱仪可以像电视专业人员一样来处理指纹以获得更接近和更好的信息。
1+1+1=3
目前已有许多用于药物筛查的技术，它们各有其优缺点。决定采用什么系统主要依据一个特殊试验室要做什么种类的筛查。例如要考虑的是大多数筛查会用于急症室病例吗？是否要对大量在不大可能用药的工作场所工作的人员的尿液进行筛查？用于康复门诊的药物需要监测吗？或法医应用的筛查？试验室可能需要用一种以上的技术来达到完成任务所要求的恰当水平。
一个阳性的鸦片制剂免疫筛查结果可能足以使急症室医师开始支持生命的治疗过程和可能的抗鸦片拮抗剂治疗。至于患者究竟服用的那一类特殊鸦片并不影响治疗过程。同样的阳性鸦片制剂免疫测定结果如果出现在没有使用过药物的工作场所则意味着医学资源官员要检查询问样品提供者，以找出鸦片是来自非处方药、处方药、使用海洛因或是用罂粟种子制的当作早餐的硬面包圈。在法医背景下，实验室工作人员决不要仅仅依靠单一的检测方法发出阳性报告。一份阳性结果如果来自与第一种测定方法不同的第二种测定方法是可取的（换句话说鸦片检测结果应是免疫测定筛查和TLC筛查均呈阳性），可能的话应采用质谱仪来精确地识别鸦片。
撒尿与否是个问题
样品是什么？
答案取决于你究竟想发现什么。在大多数情况下尿液是一个很好的样品。当药物通过机体时，亲本药物和很多代谢物都会通过尿液排出。药物在使用后的很短时间内即可在尿液中积聚。由于药物的清除需要几个半寿期，所以大多数的药物或其代谢物在使用数天后都还可以在尿液内检出。也有很多药物可以淤积在头发中，因而即使头发在继续生长也可作为一种样品。汗斑可当作数天前的汗液样品供监测药物用。对强制执行的服药后的驾车者可采集口腔液体作为样品，酒精呼气试验亦是一个重要的样品。对尿液和血液样品一同检查对执行与法律有关的案例是有用的，可以先取尿液样品作药物筛查然后再用血液样品进行筛查和定量。死后毒物学常规采用的样品通常是尿液、血液、玻璃体液体和各种器官组织。
在所有正确的地方寻找药物
本文简要列举说明了一些最常用的药物筛查技术。方法学和样品类型的选择多种多样，有没有什么特殊指南？
人行为（Human Performance）毒物学是由不同的管理机构应用于对特殊运动的运动事件进行管理的一门科学。NHL、NFL、MLB、IOC、NCAA对运动员都有着不同的试验要求和必备条件，有些甚至要求马也要通过药物筛查。
在工作场所进行的药物试验通常由物品滥用和精神健康服务部门（Substance Abuse and Mental Health Services Administration,SAMHSA）管理，具体就是确定使用哪些类型的样品和哪些类型的检测方法。SAMHSA亦制订有特殊药物浓度界限值和进行特殊确认所必备的条件。
法医毒物学（包括死后毒物学、人行为毒物学、法医尿液毒物试验）也有很多选择。每种提供的结果都要满足州和地区法规有时甚至是联邦法规的要求。
由于可供选择的测定方法和药物都有很多，因而要结合某些药物在整个国家的应用状况来进行选择。例如美国加利福尼亚洲法医实验室的药物筛查方法就可能与缅因州实验室采用的方法不同。
2007年9月美国法医学学会主办的官方杂志——法医学杂志 （Journal Forensic Science）发表了一篇有关药物影响下驾车领域的一些相关问题的论文。作者在文摘中指明“目前美国法医毒物实验室内有关哪些药物应该试验、试验分析的界限值是多少等均没有共同标准。但在实验室之间有一些实践方面的统一，可以保证对与驾车伤害最有关联的药物的评估相一致，并应用合适方法以筛查和肯定药物的存在”。这篇论文亦包含了美国各地实验室的一些检查结果。文章建议设立一个目前尚缺乏的标准水平。
这是对来自古希腊根源的检查领域的一个令人激动的新发展。
附：常用缩略词（按字母程序）
CE 毛细管电泳
CEDIA 克隆酶供体免疫测定
DUI 药物影响下驾车
DRE 药物识别专家
ECD 电子捕获检测器
ELISA 酶联免疫吸附试验
FPIA 荧光偏振免疫测定
EMIT 酶放大免疫测定技术
FID 法医身份鉴定
GC 气相色谱仪
GC-MS 气相-质谱仪
HPLC 高效液相色谱
IA 免疫测定
IOC 国际奥林匹克委员会
LC-MS 液相-质谱仪
LSD 二乙麦角酰胺（一种致幻药）
MDA 一种合成发情药，有时见于致幻剂药片内，化学名为亚甲基二氧苯丙胺
MDMA MDA的N甲基类似物
MEIA 微粒子酶免疫测定
MLB 棒球联合总会
MS 质谱仪
NCAA 国家大学生运动协会
NFL 国家足球联合会
NHL 国家曲棍球联合会
NPD 氮-磷检测器
pH 测溶液酸或碱的一种方法
PDA 光电二极管列阵检测器
RIA 放射免疫测定
SPE 固相萃取
TIC 总离子计数
TLC 薄层色谱
参考文献（略）
作者简介：Jeffrey H. Hays,BS Chemistry,美国Medical Examiner’s Office and Forensic Laboratory 法医毒物学专家。
摘自《美全诊断论坛》2008 1 总第28期
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