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输血前免疫血液学检查---疑难配血
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北京市红十字血液中心   范道旺

血液标本的采集及准备

  1. 输血申请单:必须含有病人姓名、身份号、住院号、床号及负责医师的签名。还应包含申请日期、用血原因及时间、用血种类及数量;病人出生年月、性别、种族、疾病诊断、输血史、妊娠史、输血反应史、有无不规则抗体及血型等。

  2. 受血者血样:
    ① 认真核对后,方可采集;
    ② 血液标本必须收集到有正确标记的带塞子的试管里,且标明病人姓名、住院号、采集日期及采集者;
    ③ 血液标本应是不抗凝血,以避免纤维蛋白、抗凝剂成分对血清学试验的干扰;
    ④ 溶血或混入静脉输注液体而致标本稀释的血液标本不得使用;
    ⑤ 须用输血前3天以内采集的血液标本;
    ⑥ 输血后,病人的血液标本须在1~4℃至少保存7天,以备重复试验。

  3. 献血员血样:
    ① 从血袋上附着的血样小辫获得献血员血液标本;
    ② 在标本收集管上粘贴血袋上有关血液制品号的条形码标签;
    ③ 准确核对血袋上及标本管上的号码。

血清学试验

  一、受血者试验

  (一)血型鉴定

  1. ABO血型鉴定:

⑴ 常规鉴定:
    ① 正定型:用抗-A抗-B试剂检测受血者红细胞。
    ② 反定型:用A和B型试剂红细胞检测血清中的抗体。
    人ABO血型是由红细胞的抗原和血浆/血清中的抗体所决定,因此正反定型的结果应该一致。

            表1 常规ABO正反定型试验

正定型
反定型
血型
抗-A
抗-B
AB 
O
0++0
00+A
0+0B

00AB


⑵ 如果正反定型不一致,则需进一步鉴定。可在正定型试验中增加抗-A1、抗-AB及抗-H,反定型试验中增加A2、O及自身红细胞。

            表2 疑难ABO正反定型试验

正定型
反定型
自身对照
抗-A  抗-B  抗-AB  抗-A  抗-H
A1  A2  B O
 

   正定型试验中的抗-AB是用来确认弱A和弱B抗原,抗-A1用于鉴定A亚型,抗-H用于鉴定亚型及孟买型。反定型试验中的A2细胞是用于鉴定A2亚型。O细胞用于鉴定是否存在ABO系统以外的同种抗体影响定型,自身对照用于是否存在自身抗体影响定型,如果与O细胞或自身对照为阳性,则定型结果不可靠,必须进一步进行血型鉴定。

⑶ 如果无法找到正反定型不一致的原因,则只能给病人输注O型红细胞,病人血型可请血液中心血型参比试验室协助鉴定。    

⑷ ABO定型不一致的原因:

Ⅰ、反定型试验出现弱反应或缺失抗体:
新生儿;
老人;
低球蛋白症的白血病人或淋巴瘤病人(恶性);
使用免疫抑制剂而致低球蛋白的病人;
先天丙球缺乏的病人;
免疫缺陷者;
骨髓移植病人;
双胞胎嵌合体。

Ⅱ、弱反应或缺失抗原:
  A亚型、B亚型或AB亚型;
  白血病导致A或B抗原减弱,何杰金病有时会抑制抗原表达,与白血病类似;
某种疾病(如腹腔癌、胰腺癌)导致血浆中存在大量的型物质,中和抗-A或抗-B抗体,引起正定型为假阴性或弱阳性;洗涤红细胞可解决此问题;
获得性B;
  抗-A或抗-B试剂中存在低频抗原的抗体。

Ⅲ、蛋白或血浆不正常引起的正反定型不符:
  某些疾病导致球蛋白水平增高引起缗钱状凝集,纤维蛋白原水平的增高也会引起缗钱状凝集,导致假阳性凝集;
  血浆增溶剂(葡聚糖、PVP)也会引起缗钱状凝集。
 
Ⅳ、其他原因引起的正反定型不符:
  多凝集:当病人感染细菌或病毒后,病毒或细菌产生的酶使红细胞上掩蔽的T抗原暴露激活,由于正常人血清中都含有抗-T抗体,因此可与正常人血清产生凝集反应,正定型试验假阳性;
  冷自身抗体引起的自家凝集反应,正反定型均可出现假阳性;
  存在ABO系统的意外抗体,如A2或A2B个体血清中可能存在天然抗-A1,导致反定型试验多出抗体;
被检者血清中存在ABO系统以外的同种抗体,反定型时出现假阳性反应;
  非抗-A及抗-B的抗体与相应抗原形成复合体吸附在红细胞表面,引起正定型非特异性凝集,如抗-B的染料吖啶黄。

  2. Rh(D)血型鉴定:

    ⑴ Rh(D)抗原检测原则:
       ① 对受血者常规一般只测Rh(D)抗原,而对献血员不仅要检查Rh(D)抗原,并在其为阴性的前提下必须进一步确定是否为弱Rh(D)(即D U)。
      ② Rh(D)阴性及弱D的受血者只能提供Rh(D)阴性血,不得使用D阳性及弱D的血。即弱D针对受血者而言为D阴性,而对于供血者而言则为D阳性。
      ③ 对直接抗人球蛋白试验阳性的Rh(D)阴性红细胞进行Rh(D)定型时,易引起假阳性反应,因此必须按照试剂生产商的试剂使用说明书要求,增加对照试验。

    ⑵ Rh(D)抗原检测方法:
       ① 试管法;
      ② 微柱凝胶法。

  (二)、不规则抗体的检测和鉴定:

  1. 血型不规则抗体检测:必须对有输血史、妊娠史或短期内需要接受多次输血者及交叉配血不合者进行抗体筛选试验。

⑴ 抗体筛选的重要性:有利于早期发现和确认具有临床意义的抗体,并可以在配血前鉴定此意外抗体,获得充足的时间来选择缺少相应抗原的相配合的血,避免由于寻找不到相合的血液而造成患者病情的延误。 

⑵ 抗体筛选用试剂红细胞:
  ① 试剂红细胞必须含有下列抗原:D,C,E,c,e,M,N,S,s,P1,Lea,Leb,K,k,Fya,Fyb,Jka,和Jkb
  ② 目前已商品化的试剂红细胞有两种,分别为双人份细胞和三人份细胞组。

两组细胞抗原分布图

  Rh-Hr
Kell
Duffy
Kidd
Lewis
P
MN
Lutheran
Xg
 donor
D C c E e
K k
Fya Fyb
Jka Jkb
Lea Leb
P1
M N S s
Lua Lub
Xga

R1R1
+ + 0 0 +
+ +
+ 0
++0 +
0
+ + ++
0 +

R2R2
+ 0 + + 0
0 +
+++0+ 0
+ 0 ++
+ +
0


三组细胞抗原分布图

  Rh-Hr
Kell
Duffy
Kidd
Lewis
P
MN
Lutheran
Xg
 donor
D C c E e
K k
Fya Fyb
Jka Jkb
Lea Leb
P1
MNSs
 Lua Lub
Xga

1

R1R1
+ + 0 0 +
+ +
+ 0
0 +
0 +
+++0
 0 +
0
2R2R2
+ 0 + + 0
0 +
+ +
+ +
+ 0
0+0+
 0 +
+
3rr
0 0 + 0 +
0 +
0 +
+ 0
+ 0
+00+
 0 +
+

    ③ 试剂红细胞是保存在保存液中,一旦用生理盐水或Liss液洗涤后则应该在24小时内使用,否则会因污染、抗原丢失导致试验错误。  

⑶ 抗体筛选技术:
①技术要求:
尽可能多的检测出有临床意义的抗体。
尽可能少的检测出无临床意义的抗体。
尽可能快的完成抗体检测。
②方法选择:每种方法都有自己的特点,适应于不同范围及情况。
  立即离心盐水试验技术:可以用于检测干扰ABO定型的盐水反应活性抗体,但此方法会检查出无临床意义的抗体,如冷凝集素抗-I及抗-IH等。但漏检IgG性质的抗体。

  Liss-间接抗人球技术(Liss-IAT):此方法可以有效的用于检测不规则抗体(IgG性质),目前市场上见到的微胶柱方法都是Liss-IAT的方法,如澳斯邦(AusBio)的博唯优(BioVue)、达亚美(DiaMed)的ID-卡,以及Immucol的Capture技术也是Liss-IAT方法。此方法缺点是无法排除无临床意义抗体的干扰。

  酶试验(菠萝酶或木瓜酶):很少用于输血前检查中的抗体检测,因为酶方法会破坏一些红细胞抗原,如M,N,S,Fya和Fyb, 但酶技术可以增强Rh及Kell系统的抗体检测。主要用于MNSs系统的抗体鉴定。
低离子聚凝胺技术(LIP-IAT):所需试验时间少(3~5分钟)、方法灵敏度高,但由于反应温度为室温,因此无法排除无临床意义抗体的干扰(尤其是室温盐水反应性抗体)。

  聚乙二醇-间接抗人球方法(PEG-IAT):PEG-IAT是很灵敏且有效的检测抗体的方法,可以提高反应的强度,同时此方法可以有效的避免无临床意义抗体的干扰。

    ⑷ 自身对照:即使用病人自己的血清和自己红细胞进行抗体检测,有助于确定抗体筛选阳性结果是同种抗体还是自身抗体、或是缗钱引起。

  2. 抗体鉴定:在病人血清不规则抗体检查为阳性时,且时间允许的情况下,在交叉配血之前,应该可以进行简单的抗体鉴定试验,确定抗体的特异性,会有助于选择无对应抗原的相合血。如抗-cE抗体在人群中的相合率为30%。

  二、供血者检测

  从供血中心获得的血液,交叉配血前须进行ABO定型,对于Rh(D)阴性的血液还需确认其非弱D型,并把检测结果与血袋上的标识相比较,确保一致。

交叉配血

  一、血液的选择

  (一)、血型:

  1、ABO 系统:
   ①全血:必须选择同样血型的全血。
   ②成分血:选择血型相配的血。  

病人血型
相合的红细胞
相合的血浆相合全血
000,A,B,AB0
0,AA,ABA
0,BB,ABB
AB0,A,B,ABABAB


   2、Rh系统:
    ①Rh(D)阳性患者可以选择阳性血及阴性血。
    ②Rh(D)阴性及弱D患者只能选择Rh(D)阴性血。

  3、其他系统:对于已经明确抗体特异性的病人,则应选择缺乏相应抗原的血液。

  (二)、储存时间:一般来说,首先使用较陈旧的血,但以下情况属于例外,需用新鲜血。

  1、病人将接受大量的血液(超过自身总血量)。

  2、新生儿换血及婴幼儿输血(病人本身血容量小,而用血量又大)。

  3、接受定期输血的病人(如地中海贫血病人、肾透析病人、再障病人),使输血间隔时间延长。

  (三)、新生儿换血的血液选择:

  1、Rh(D)新生儿溶血病,选择Rh(D)阴性ABO血型与婴儿和母亲相配合,或O型Rh(D)阴性的洗涤红细胞及AB型血浆,用母血清进行交叉配血。

  2、ABO新生儿溶血病,选择ABO血型与婴儿及母亲相配合的且Rh血型与婴儿相同的红细胞及AB型血浆组成的血液使用。

  3、其他任何新生儿溶血,选择不含特异性抗体所对应抗原的ABO系统与婴儿相同的血输注。 

新生儿溶血病换血用的ABO系统血型相合红细胞选择

 
婴儿血型
母血型供血者血型
00,A,B0
A0,B0
A,ABA,0
B0,A0
B,ABB,0
AB00
AA,0
BB,0
ABAB,A,B,0



   二、交叉配血:交叉配血有两个重要作用,其一是确认供血者及受血者的ABO血型的相合性,其二是可检测出受血者血清中不规则抗体,此抗体可能在抗体筛选试验中由于筛选试剂红细胞缺乏相应抗原而漏检。

  (一)主侧交叉及次侧交叉试验:

  1、主侧交叉:由病人血清及供血者红细胞组成

    次侧交叉:由病人红细胞及供血者血清组成(由于我市尚未对供血者进行抗体筛选,因此次侧交叉是非常必要的)。

    自身对照:病人自身血清及病人自身红细胞组成,自身对照有助于分析解释交叉配血试验中出现的阳性结果。

  2、常规配血技术:选择的技术不仅要能检查出不配合的IgM抗体,还必须能检查出尽可能多的不配合的IgG抗体。最大限度的减少抗体的漏检。 

    ⑴立即离心技术配血法:用于检查ABO的不配合及室温反应活性抗体引起的不配合。

    ⑵抗人球蛋白配血法:用于检查不规则抗体(IgG)引起的交叉配血不配合,有Liss-抗人球法、PEG-抗人球法、LIP-抗人球法。

  3、特殊配血技术:

⑴预温配血技术:主要用于解决室温反应活性的无临床意义的抗体引起的交叉配血不配合。

⑵冷型自家溶贫病人的配血试验,用于解决自身冷凝集引起的配血困难。

⑶温型自家溶贫病人的配血试验,用于解决自身温抗体引起的配血困难。

⑷纤原未完全析出的血样,如肾透析、凝血功能差的病人,在配血时引起假阳性。

  4、结果的解释:

⑴主侧交叉配血不相合的原因:
病人或供血者ABO定型不正确,或二者的ABO血型不配合。
病人血清中存在同种抗体,与供血者红细胞上的相应抗原反应。
病人血清中存在自身抗体,与供血者红细胞上的相应抗原反应。
供血者红细胞上已经包被了抗体,导致抗球蛋白试验阳性。
病人血清不正常,如白蛋白/球蛋白比例不正常引起缗钱状假凝集,血清中存在高分子聚合物的血浆扩容剂引起假阳性(用盐水添加试验来解决)。
试验系统被污染。
⑵次测交叉配血不相合的原因:
供血者血浆中存在针对病人红细胞抗原的抗体。
病人与供血者的ABO血型不相合。
病人的红细胞已经包被了抗体,直接抗人球蛋白试验阳性。

主侧配血不相合原因分析


现象
可能原因解决方案
主侧:+
自身:-
抗体筛选:-
病人或供血者ABO错误
病人血清可能含ABO抗体
病人血清中有抗体,但筛选细胞上无相应抗原
供血者红细胞直接抗球蛋白试验阳性
重新定型
检查病人亚型、输血史及移植史
对病人血清进行抗体鉴定
检查供血者直接抗球蛋白试验
主侧:+
自身:-
抗体筛选:+
病人血清中的同种抗体与供血者红细胞上相应抗原反应对病人血清进行抗体鉴定,选择无对应抗原的血
主侧:+
自身:+
抗体筛选:+
病人血清中可能同时存在自身抗体和同种抗体
病人血清不正常:
白蛋白/球蛋白比值不正常
血浆扩容物
污染
对病人血清自身吸收及抗体鉴定,用吸收后血清配血
盐水添加试验解决缗钱
抽去新标本
使用新器具


             *抗体鉴定可由血液中心来检验

抗体鉴定  

  可以鉴定抗体的特异性,有助于给病人选择相配合的血液,还可以预防新生儿溶血病。

  一. 一般程序:

(一) 血液样本:血清或血浆均可,但更多用血清。

(二) 病史:记录病人临床诊断、输血史、妊娠史和近期使用的药物。

(三) 试剂:
谱细胞:是挑选出的10个或更多个已知血型表现型的O型细胞。谱细胞必须含有Rh、Kell、Duffy、Kidd、P、Lewis和MNS系统的抗原,且对大部分单一的同种抗体有一个清楚的反应格局。
增强介质:LISS、PEG和LIP等,均有商品供应。
抗人球蛋白试剂:抗-IgG和抗-IgG+抗-C3;但抗-IgG使用的更多。
(四) 自身对照:有助于决定病人是否有同种抗体,或有自身抗体,或两者兼有。

  二. 血清学方法的选择:

  无任何单一的方法可以检查出所有的抗体。在选择方法时必须了解此方法的特异性、灵敏度、局限性、假阳性和假阴性情况。影响抗原-抗体反应的因素有孵育温度、提高血清对细胞的比例、延长反应时间、改变pH和低离子强度。

1. 抗体鉴定技术:①低离子强度液(LISS)-IAT②聚乙二醇(PEG)-IAT③微胶柱凝集技术④聚凝胺(LIP)-IAT⑤酶技术。

2. 抗体鉴定中的特殊技术:①使用硫醇试剂②吸收试验③放散试验④效价

已配合血液的标记及发放

  取血与发血的双方必须共同查对病人姓名、性别、疾病诊断、病案号、门急诊/病室、病床号、ABO及Rh血型;血液有效期、血制品名称、数量和外观、供血者编号;交叉配血试验结果、试验人员姓名等;确保准确无误时,经双方共同签字后方可发出。

  血液发出后,受血病人及供血者的血液样本至少须保存于2~6℃冰箱7天,以便追查输血不良反应的原因。

 不规则抗体筛选和鉴定的方法方法有很多,试总结一下它们各自应用范围和优缺点。

参考文献

Sally V. Rudmann,“Textbook of blood banking and transfusion medicine. ”1995, by W. B. Saunders Company.P282~347
Denise M.Harmening,“ModernBlood Banking and Transfusion Practise” , Third edition, 1994 by F. A. Davis company. P256~277.
Mary Louise Turgeon,“Fundamentals of Immunohematology ” (theory and technique), 2nd edition, 1995, by Williams & Wilkins,p143~256.
吕鹏主编:最新输血技术学。 1994,人民卫生出版社。P179~210.

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