作者：尚慧锋，陈国光，王 艳，王玉珀   
作者单位：太原市第四人民医院

       【摘要】 目的：探讨建立更快速、准确的痰结核分枝杆菌检测方法。方法：采用涂片抗酸染色法、快速结核菌培养法和荧光定量PCR技术对痰结核分枝杆菌进行检测，并对其检出率进行比较。结果：荧光定量PCR技术的检出率最高，快速培养法次之且检测时间较长，抗酸染色法检出率最低。结论：荧光定量PCR技术能对痰结核分枝杆菌进行简便、快速、敏感、特异的检测，在肺结核的早期诊断和疗效观察中将能发挥重要作用。

       【关键词】 涂片抗酸染色法；快速结核菌培养法；荧光定量PCR技术；结核分枝杆菌；阳性率比较

       目前从痰中检测结核分枝杆菌仍是诊断肺结核的重要方法，痰结核分枝杆菌检查对发现传染源、确定治疗方案、考核疗效、评价防治效果等具有重要意义。本文对558 例肺结核患者及疑似患者痰标本同时进行涂片抗酸染色法、快速结核菌培养法和荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌，并对3种方法的阳性率进行比较，为临床提供更实用、科学的检测方法。

       1、资料与方法

       1.1  标本

       558 例痰标本来自本院门诊和病房的肺结核患者及疑似患者，嘱患者清晨嗽口，然后从深部咳痰2～3口于一次性无菌塑料瓶内送检。

       1.2  试剂与仪器

       萋尼氏染色试剂(按文献［1］的方法自行配制)、痰消化液、pH6.8的磷酸盐缓冲液、结核分枝杆菌PCR荧光定量检测试剂盒及DA7600荧光定量PCR仪(深圳达安生物技术有限公司提供)、显微镜(日本奥林巴斯)、低温高速离心机(美国Thermo Fisher Scientific)、生物安全柜(美国NUAIRE)、BacT/ALERT 3D全自动分枝杆菌培养检测系统(购于生物梅里埃有限公司)。
　
       1.3  方法

       1.3.1  涂片抗酸染色法　

       所有操作严格按照《抗酸杆菌涂片检查操作程序》(中国疾病预防控制中心结核病防治临床中心与国家结核病参比实验室制订)进行。

       1.3.2  快速结核菌培养法

       取痰标本，采用半胱氨酸氢氧化钠法前处理(左旋半胱氨酸临用时配制)。视标本性状，加1～2倍体积的处理液于无菌痰杯中，使痰液充分液化，整个处理时间不超过20 min，移入50 mL离心管振荡均匀并加入pH6.8的磷酸盐缓冲液至50 mL处，4 000 rpm离心20 min，弃上清液，加0.2％牛血清1 mL，混匀。取0.5 mL加入到BacT/ALERT 3D培养管(预先以75％乙醇消毒瓶口，待自然风干后，加入0.5 mL抗生素补充剂)，以上操作均在生物安全柜内进行。BacT/ALERT 3D培养管置仪器培养，去除阳性标本，阴性标本42 d报告结果［2］。

       1.3.3  荧光定量PCR技术

       取痰标本，加入4倍体积的4％氢氧化钠溶液，摇匀，室温液化30 min，取1～1.5 mL，15 000 rpm离心5 min，弃上清液，沉淀用无菌生理盐水1 mL打匀，15 000 rpm离心5 min，重复洗涤1次，弃上清液，沉淀加入50 μL DNA提取液，充分混匀后沸水浴10 min，10 000 rpm离心5 min，取5 μL样本加入到PCR管内，设置反应体系，扩增完计算机自动分析，建立标准曲线，计算出标本中扩增片段的拷贝数。